1. <p id="zzolg"></p>
        2. 應用支持

          application examples
          應用支持

          DLPME-HPLC同時測定微量人血清中的維生素A和E

          鄭鳳家1別明江2孫成均1*

          1.四川大學華西公共衛生學院,成都610041;

          2.四川大學華西第四附屬醫院檢驗科,成都,610041

          摘要:[目的]建立了人血清中維生素A和E的分散液相微萃?。╠ispersive liquid phase microextraction,DLPME)-高效液相色譜分析方法。[方法]取血清20μl,加入50μl甲醇,漩渦震蕩10s后加50μl三氯甲烷超聲萃取,高速離心后吸取下層三氯甲烷層供高效液相色譜分析,標準曲線法定量。色譜分析條件為:色譜柱為Eclipse XDB – C8(150 mm × 4.6 mm,5μm);流動相為甲醇-水(96+4);流速為0.80 ml/min;柱溫為25℃;紫外檢測波長:維生素A為325nm,維生素E為292nm。[結果]維生素A和E標準曲線的相關系數均大于0.999;相對標準偏差均小于5%。對于20μl血清,本法的檢出限維生素A為0.035μg∕ml;維生素E為0.09μg∕ml。維生素A和E的加標回收率分別為90.4%~103.2%和81.0%~92.1%。[結論]本法靈敏、準確、快速、簡便,節約有機溶劑,適合于血清中維生素A和E的快速測定,是環境友好型的綠色分析方法。

          關鍵詞:分散液相微萃??;維生素A;維生素E;高效液相色譜;血清

          Simultaneous determination of vitamin A and E in microamount of human serum by dispersive liquid phase micro-extraction – high performance liquid chromatography

          ZHENG Fengjia, BIE Mingjiang, SUN Chengjun*

          West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China

          Abstract:[Objective]To establish a dispersive liquid phase microextraction–high performance liquid chromatography for simultaneous?determination of vitamin A and E in microamout of human serum.[Method]Twenty microliter?of human?serum was taken and 50μl?methanol added to precipitate?the protein, and 50μl chloroform?added to extract vitamin A and E ultrasonically. After centrifuged at 12000rpm for 5 min, the lower chloroform layer was taken and injected for HPLC analysis. The optimized?chromatographic conditions were as follows: analytical column: (Eclipse XDB-C8,?150?mm?× 4.6?mm,5μm); mobile phase:?methanol-water (96+4); flow rate: 0.80 ml/min; column temperature: 25℃; detection wavelength: 325nm for vitamin A and 292nm for vitamin E, respectively.[Results]The correlation coefficients for the standard curves were greater than 0.999 for both vitamin A and E; the detection?limits?of the method were 0.035μg?∕?ml?for vitamin A and 0.09μg?∕?ml?for vitamin E. The recoveries of vitamin A and E in human serum ranged from?90.4%~103.2% and?81.0%~92.1%, respectively.[Conclusion]The method is sensitive,?accurate, rapid, simple,?and suitable for the determination?of vitamins A and E in microamount of human serum.

          Key words :Dispersive liquid phase microextraction;Vitamin A;Vitamin E;Human Serum;High performance liquid chromatography

          ::__IHACKLOG_REMOTE_IMAGE_AUTODOWN_BLOCK__::0*通訊聯系人:孫成均,教授。E-mail:sunchj2005@yahoo.com.cn

          維生素A 和維生素E是維持機體正常生長的必需脂溶性維生素。目前,國內外測定血清[1]和全血[2]中維生素A和E的方法很多。這些方法中的前處理技術有液-液萃?。?]、固相萃?。?]、濁點萃?。?]等等。這些前處理技術有的繁瑣耗時、需要較多有機溶劑,且血清量需要量較大。整個樣品分析過程中,前處理過程所需的時間占整個分析時間的2/3,并可能產生1/3以上的誤差[5]。分散液相微萃?。╠ispersive liquid phase micoextraction, DLPME)技術首先見于Rezaee等[6-7]的報道,該法集萃取和濃縮于一體,是一種操作簡單、快速、成本低且對環境友好的樣品前處理新技術?,F在分散液相微萃取技術對生物樣品和環境樣品中的農藥[8-10]、重金屬[11-12]等的提取報道很多,但在血清中維生素A和E的測定中尚未見報道。

          本文將該技術應用于萃取濃縮微量人血清中的維生素A和E,大大縮短了分析時間,減少了樣品和有機溶劑的用量,降低了分析成本,為分析人微量血清中維生素A和E的含量提供了快速、簡便、準確、靈敏的方法,在人群血清維生素A和E的快速檢測中有很好的應用價值。

          1. ?實驗部分

          1.1.儀器與試劑高效液相色譜儀(EX1600,上海伍豐科學儀器有限公司),帶紫外檢測器(EX1600UV);C8柱(Eclipse XDB-C8,4.6 mm × 15 cm,5.0μm),同類型保護柱;WH-1微型漩渦混合儀;臺式高速離心機(Anke TGL-16B);超聲波清洗器(KQ-250型)。維生素A(視黃醇)標準品(FLUKA,>99%);維生素E標準品(Sigma,>95%);三氯甲烷(色譜純);甲醇(色譜純);維生素A標準儲備液(1mg/ml):甲醇配制,于-20℃冰箱冷藏保存;維生素E標準儲備液(2mg/ml):甲醇配制,于-20℃冰箱冷藏保存;維生素A和E混合標準應用液(VA 1μg/ml,VE 5μg/ml):測定前,按文獻[13]方法對維生素A和維生素E標準儲備液濃度進行標定,再以其實際濃度用甲醇稀釋成混合液。實驗用水為Millipore超純水(18.2 MΩ·cm)。

          1.2實驗方法

          1.2.1色譜條件流動相為甲醇-水(96+4),超聲波脫氣后使用;流速:0.8 ml/min;柱溫:25℃;波長切換程序:0~5.0min,325 nm,5.0~10min,292 nm。

          1.2.2標準曲線的繪制在高效液相色譜儀基線達平直后,分別進樣VA 和VE 混合標準應用液?2.00、5.00、10.0、20.0μl(相當于VA ?2,?5,10,20ng,?VE ?10,25,50,100?ng),以保留時間定性,記錄各自峰面積。分別以VA和VE含量(ng)?對峰面積線性回歸。維生素A和E標準色譜圖見圖1。


          圖1維生素A和E混合標準色譜圖

          Fig 1 The chromatogram of vitamins A and E standard solution

          1.維生素A(Vitamin A,3.8min) ?2.維生素E(Vitamin E,8.4min)

          1.2.3 樣品處理與測定取新鮮人血清20μl于200μl EP管中,加入50μl甲醇漩渦混勻10s,然后加入50μl三氯甲烷,超聲萃取3min后,以12000 r/min離心5min。用微量進樣針伸入EP管底部取10μl萃取液進樣分析,樣品圖譜見圖2。

          1.2.4 結果計算 ???根據樣品圖譜維生素A和E的峰面積,通過回歸方程計算進樣液中維生素A和E的含量(ng),按下式計算血清中維生素A和E的濃度(μg /ml)。

          式中:::__IHACKLOG_REMOTE_IMAGE_AUTODOWN_BLOCK__::3為維生素A和E的濃度(μg/ml),::__IHACKLOG_REMOTE_IMAGE_AUTODOWN_BLOCK__::4為由回歸方程計算的進樣液中維生素A或E的含量(ng)。

          圖2樣品萃取后維生素A和E的色譜圖

          Fig 2 The chromatogram of a human serum sample

          1.維生素A(Vitamin?A,3.8min) ??2.維生素E(Vitamin E,8.4min)

          2結果與討論

          2.1液相微萃取條件的優化

          2.1.1 ?液相萃取劑的選擇 ??實驗選取了三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷3種有機溶劑進行萃取條件試驗。試驗結果表明,在相同條件下,三氯甲烷的萃取效率及其穩定性要高于二氯甲烷和正己烷,二氯甲烷盡管萃取效率高,但易揮發,結果不穩定,故本法選三氯甲烷作為液相微萃取劑。

          2.1.2 ?三氯甲烷萃取劑體積的選擇 ?實驗選擇了20μl、40μl、50μl在相同條件下萃取樣品,當萃取劑體積為20和40μl時,萃取效率偏低,且不穩定,當萃取劑量達到50μl時,萃取效率達到分析要求,且實驗結果穩定性好,因此選擇三氯甲烷萃取劑的體積為50μl。

          2.1.3 ?超聲萃取時間的選擇分散液相微萃取是一個樣品的富集平衡過程,需要一定的時間。實驗研究了1min、3min、5min這三個時間點的超聲萃取效果,3min時效果最佳,而1min時萃取效率過低,這可能與超聲時間過短,尚未達到富集平衡有關。5min時實驗結果不穩定,這可能和超聲時間過長,萃取劑揮發損失以及維生素A和E部分分解有關。所以,本法選擇超聲萃取時間為3min。

          2.2 ?方法性能指標

          2.2.1標準曲線和工作曲線本法實驗條件下,維生素A和E的線性范圍遠大于實驗范圍,考慮到本法主要用于微量血清中維生素A和E的測定,故未測定線性范圍上限。在本實驗線性范圍內,維生素A的標準曲線方程為:A=677.8m?+23.95,相關系數r=0.9991;維生素E的標準曲線方程為:A=32.85m+70.5,相關系數r=0.9999。為了檢驗分散液相微萃取過程對標準系列的影響,在樣品微萃取條件下對標準系列進行處理后再測定,結果所得維生素A的工作曲線方程為:A = 605.31m?+18.85,相關系數r=0.9990;維生素E的工作曲線方程為:A?=?35.96 m+60.8 ,相關系數r=0.9990.分別對維生素A和E的標準曲線和工作曲線的斜率進行t檢驗,得p>0.05,即標準曲線和工作曲線的斜率無顯著性差異,所以本法采用標準曲線法來計算樣品中的維生素A和E的含量。

          2.2.2 ?方法的檢出限 ?以儀器基線的3倍噪聲所對應的待測物在進樣液的濃度為方法的檢出限,以20μl血清,最終稀釋至50μl,取10μl進樣,計算出樣品中維生素A和E的最低檢出濃度為0.035μg∕ml和0.09μg∕ml。完全可滿足實際樣品測定的要求。

          2.2.3 ?方法的精密度取6份同一血清,各20μl,按樣品處理方法提取和測定,計算方法的精密度(表1)。由表1可見,本法維生素A和E測定值的相對標準偏差分別為7.78%和5.43%。

          表1 ??方法精密度實驗結果(n=6)

          維生素 含量范圍(ng) 均值(ng) SD(ng) RSD(%)
          Vitamin A 1.84~2.11 1.93 0.15 7.78
          Vitamin E 21.0~23.1 21.91 1.19 5.43

          2.2.4 ?方法準確度實驗 ???在3份相同樣品中,分別加入不同量的標準溶液,再按本法處理和測定,根據加標前后測定值計算加標回收率,實驗結果見表2。由表2可見,本法維生素A和E的加標回收率分別為90.4%~103.2%(平均為94.9%)和81.0%~92.1%(平均為86.6%)。

          表2 ??方法加標回收率

          維生素 背景值(ng) 加標量(ng) 測定值(ng) 回收率(%)
          0.63 2.37 90.4
          Vitamin A 1.80 1.26 3.10 103.2
          2.52 4.10 91.2
          8.77 28.1 81.0
          Vitamin E 21.0 21.9 40.0 86.8
          43.8 61.3 92.1

          2.2.5樣品測定用本法測定了15名健康成人的血清,所測維生素A的含量范圍為(0.56±0.05)μg/ml。維生素E的含量范圍為(8.46±0.57)μg/ml,與相關文獻的報道值一致。

          3 ?結論本文建立了分散液相微萃取-高效液相色譜法分析維生素A和E的方法,該法操作簡便,大大縮短了分析時間,節約了試劑,是環境友好型的分析方法,在維生素A和E的快速檢驗中有著很好的推廣應用價值。

          參考文獻

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